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May 16, 2023

ショウジョウバエの卵サイズ測定のためのハイスループットな方法

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3791 (2023) この記事を引用する 689 アクセス数 2 引用数 4 Altmetric Metrics の詳細 生活史の形質は、昆虫の適応度の代理として使用されます。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3791 (2023) この記事を引用

689 アクセス

2 引用

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

生活史の形質は、ショウジョウバエを含む昆虫の適応度の代用として使用されます。 卵の大きさは適応的で生態学的に重要な形質であり、異なる集団間での遺伝的変異を伴う可能性があります。 しかし、卵の大きさの手動測定のスループットが低いため、進化生物学や集団遺伝学におけるこの形質の広範な使用が妨げられてきました。 我々は、大粒子フローサイトメトリー（LPFC）を使用してショウジョウバエの卵サイズを正確かつハイスループットに測定する方法を確立しました。 LPFC を使用したサイズ推定は正確であり、手動測定と高い相関性があります。 卵サイズの測定は高スループット (1 分あたり平均 214 個の卵を測定) で、特定のサイズの生存可能な卵を迅速に選別できます (1 分あたり平均 70 個の卵)。 LPFC による選別は卵の生存率を低下させないため、下流分析用の卵を選別するのに適したアプローチです。 このプロトコルは、大粒子フローサイトメーターの検出可能なサイズ範囲 (10 ～ 1500 μm) 内のあらゆる微生物に適用できます。 この方法の潜在的な応用について説明し、他の生物のプロトコルを最適化するための推奨事項を提供します。

卵の大きさは、発達上および生態学的圧力に応じて進化してきた昆虫の重要な特性です1。 卵の大きさやその他の生活史特性（生存、寿命、メスの繁殖力など）は、昆虫の適応度の代用となります。 キイロショウジョウバエでは、卵の大きさが他の生活史形質、たとえば胚の生存率、孵化率、胚の発育 2、および胚の前後パターンなどの形態学的特徴に影響を与えます 3,4。 幼虫の混雑5と温度などの環境要因は、キイロキイロショウジョウバエの卵の大きさに影響を与えます6、7、8。 キイロショウジョウバエの卵サイズは、オーストラリアと南米では緯度に応じて増加します7。これは、それが安定化選択の下での適応形質であることを示唆しています2。 ショウジョウバエは、進化生物学において最も広く使用されている有性多細胞生物の 1 つです。 この人気の理由の一部は、ショウジョウバエの世代時間が短く、実験室条件でのメンテナンスが容易であることです。 ショウジョウバエは広く使用されているにもかかわらず、手動による卵サイズの測定のスループットが低いこともあり、進化学や集団生物学の研究では卵のサイズが研究されることはほとんどありません。

伝統的に、卵のサイズは顕微鏡または立体視鏡で観察して測定されていました2、7、8、9、10。 あるいは、卵を顕微鏡で撮影し、画像から手動でサイズを測定します3、4、11、12。 最近、物体のサイズを自動的に計算するいくつかの画像分析ツールが開発されました 13,14。 手動測定に依存する方法は、画像を撮影する前に卵を手動で移し、適切な方向に配置する必要があるため、時間がかかり退屈です。 卵のサイズを手動で測定する場合も、実験者のバイアスにより誤差が生じやすくなります。 画像分析パイプラインでは、特定の色と明るさの背景で標本を撮影することも必要です13。 さらに、手動測定や画像分析ツールでは通常、下流の分析に使用できる生存可能な卵の回収を保証できません。

フローサイトメトリーにより、最大 200 µm までの小さな対象物の高速かつ正確な選別とサイズ測定が可能になります。 しかし、D. melanogaster 種のサブグループの卵の平均サイズは 400 ～ 600 µm であり、従来のフローサイトメーターで処理するには大きすぎます。 大粒子フローサイトメトリー (LPFC) の出現により、最大 1500 µm の生きた物体の測定が可能になりました。 LPFC システムは、破壊的なせん断力を回避するために、従来のフローサイトメーターに比べて遅い流量と低い圧力で動作します。 LPFC は、蛍光標識生物やトランスジェニック生物、たとえば線虫 15、キイロショウジョウバエ 16、ガンビアハマダラカ 17 の卵、サンゴ幼生 18 などの分析に使用されています。 非蛍光標識オブジェクトも、そのサイズのみに基づいて LPFC で分析および分類できます。 ただし、蛍光標識がない場合、物体の形状がサイズ推定の精度に影響します。 たとえば、シロイヌナズナの種子の形状は長球状または心臓状19であるため、シロイヌナズナの種子のサイズ測定は種子の向きにほとんど依存しません20。 ただし、ショウジョウバエの卵などの扁円形または長円形の楕円体形状を持つオブジェクトの場合、推定サイズはフローサイトメーター内のオブジェクトの向きに応じて異なる場合があります。 物体のサイズは、物体が軸に沿って配向されている場合にのみ適切に測定されますが、物体が軸に沿って通過しない場合は過小評価される可能性があります (図 1A、B)。